现有技术条件下，对化学品如何做急性眼刺激性体外试验的思考

眼刺激性测试试验在农药、兽药、化妆品、洗化用品、新化学品等化学品的登记注册、新品研发、质量检测等领域属于常见的毒性检测资料之一。由于这些化学品对眼睛的刺激性伤害，不仅会造成眼部损伤，而且可能还会由于局部刺激致使结膜的血管和淋巴管扩张，最终引起全身毒副作用。所以想要充分、合理、安全使用化学品，眼刺激性试验就成为评估、测量化学品毒性的重要参考测试内容之一。

一、现有眼刺激试验标准分析

目前我国现行的化学品眼刺激性检测标准体系，主要参考的是美国FDA基于兔眼刺激试验标准而建立起的测试方法。

这种方法学在眼刺激性试验研究初期得到广泛应用，但是随着动物试验的“3R”原则在国际上达成的共识，寻找更科学的体外替代试验方法逐渐成为大家评价化学品毒理学安全性的重要手段。此外在 Draize 兔眼刺激试验中，靠肉眼观察的主观分析性评价方法很难做到客观与量化，只能在一定程度上进行定性的区分，难以显示出细微差别，也不利于大批量检测和一致性评价。

二、现行眼刺激试验标准列表

我国现行眼刺激试验标准大约共 14 项（如下表），其中国家标准 4 项，行业标准 3 项，团体标准 6 项，地 方标准 1 项；化学品检测的标准 3 项，化妆品检测标准 9 项，农药检 测标准 1 项，保健产品检测标准 1 项。

上表中，国家标标准1、2、3、4和地方标准14均是传统的体内 Draize 兔眼刺激试验。行业标准5、6、7和团体标准8、9、10、11、12、13均为化妆品的体外替代测试方法，检测对象特定。根据检测原理这些标准可以分为细胞膜损伤检测（5、8 、9 、 11）、细胞毒性检测（6）和非实验动物组织替代兔眼检测（7、10、12、13）。这些检测方法不能完全模拟眼刺激发生时的机体环境，检测的毒性指标为毒效应的终点指标，无法反映毒作用早期的变化，灵敏度不足。并且这些方法不能反映眼刺激发生的分子机制，有较高的假阳性和假阴性率。因此，本文提出针对化学品可建立通用性、灵敏、准确的基于 TRPV1 通道活性检测的眼刺激性测试方法。

三、TRPV1 活性检测技术

TRPV1 是一种对钙离子有高渗透性的非选择性阳离子通道，主要分布于背根神经节和三叉神经节中的神经元。

通常情况下，眼刺激性化学品可以通过激活眼球的感受器，释放炎症介质，使眼球产生刺激性症状，因此可以通过测试这些感受器的活性状态反映受试物的眼刺激性。伴随着三叉神经眼支的感觉神经纤维，TRPV1 广泛分布在角膜、虹膜、结膜、泪腺等眼部结构。眼刺激性化学品可激活 TRPV1引起细胞外 Ca2+内流，导致细胞内 Ca2+浓度迅速升高。因此，通过测试化学品作用于TRPV1-HEK293细胞后的胞内Ca2+浓度改变，反映 TRPV1 活性的实时变化，从而定性地检测化学品的眼刺激性反应。

四、TRPV1 活性试验步骤介绍

本试验采用稳定转染TRPV1的人胚胎肾293细胞为检测对象，固体受试物以最大溶解度下的溶液作为受试溶液，液体受试物以原液为受试溶液。TRPV1-HEK293细胞先与Ca2+染料孵育，在470 ~ 495 nm激发波长下，515 ~ 575nm范围内以1s的采样间隔采集基础荧光信号F0。测试开始后，先不加样品，连续检测细胞板的基线荧光强度60 s，以最初10个时间点荧光信号的平均值作为基础荧光强度值（F0）。随后，自动加样并连续检测荧光强度值（F）400 s，检测时间共460 s。分别计算每个测试时间点各孔荧光强度F的平均值F和相对荧光强度F/F0，生成时间-F/F曲线。计算时间-F/F0曲线60 s ~ 300 s的曲线下面积（Area Under Curve，AUC），将AUC值作为钙离子内流效应的衡量指标。

五、计算方法

试验按照下列方程进行计算：

式中，AUCB指空白孔的AUC值，AUCHBSS 指缓冲液对照孔的AUC值，AUCSC 指溶剂对照孔的AUC值，AUCPC指阳性对照孔的AUC值，AUCC- 指受试样品无辣椒平孔的AUC值，AUCC+指受试样品辣椒平孔的AUC值。

六、判定原则

结果判断规则如下：

（1）首次测试时，如EB < 10%、ESC < 10%，同时EPC > 150%，试验结果有效。

（2）受试样品的EC- < 20%，样品无刺激性。

（3）受试样品的EC- ≥ 20%，且EC+ ≤ 75%，样品具有潜在眼刺激性。

（4）受试样品的EC- ≥ 20%，但EC+ > 75%，则需将样品进行稀释后进行二次测试。二次测试的结果中，受试样品任一浓度的EC+ ≤75% EC-，样品具有潜在眼刺激性。

（5）若测试结果不符合上述标准，可按照GB/T 21609-2008的方法检测。

七、思考总结

全球化学品统一分类和标签制度将可能接触眼睛的化学品分为两大类

第 1 类是指用于眼球表面 后能造成严重的眼组织损伤或视力衰退，且 21 天内不完全可逆的化学品；

第 2 类是指用于眼球表面后引起眼部及其周围黏膜炎性变化，21 天内完全可逆的化学品，第 2 类又可进一步细分为“2A 类”（炎性变化 7 天内可逆）和“2B 类”（炎性变化 7 天内不可逆）；其余化学品归为 UN GHS 未分类物质。

欧洲替代方法验证中心建议采用“自下而上”或“自上而下”的方法检测化学品的眼刺激性。两种方法的关键点在于筛选出“两头极端”的物质，即优先使用能够准确可靠地鉴定出无眼刺激性或严重眼刺激性化学品的替代试验。

基于 TRPV1 的活性检测，优势即在于能快速有效筛选出无刺激性或强刺激性化学品。检测方法基于眼刺激发生的分子机制设计，从分子水平检测受试物的眼毒性，灵敏度高，可靠性强，可作为化学品急性眼刺激试验的预筛选方法，或作为体外替代试验组合的组成部分。对比传统的检测法， TRPV1活性检测可有效降低检测成本、检测灵敏度和准确度高、符合减少、优化和替代动物试验的研究趋势。

我国对替代方法的研究起步较晚，虽然少部分毒理学指标已经有相关的国家标准出台，但基本都是以 OECD 指南作为基础，材料及使用设备依赖进口，排他性强，导致试验成本高，提高了替代试验的推广难度，而化学品眼刺激性检测尚无形成国家标准的体外检测方法。可以预见 TRPV1 的活性检测方法一旦推广开来，对国内化学品眼刺激的替代试验的体外评价体系建立有着积极的促进作用。